Estudio bioquímico, genético y biotecnológico de las rutas metabólicas responsables de la degradación de tiramina y de ácido 4-OH-fenilacético en Pseudomonas putida U.

INTRODUCCION
LBIODEGRADACION DE AMINAS BIOGENICAS.
1.1.Aminas biogénicas. Aspectos generales
1.2.Aminas biogénicas como neurotransmisores.
1.3.Presencia de aminas biogénicas en los alimentos.
- Presencia de aminas en alimentos no fermentados
- Presencia de ominas en alimentos fermentados.
1.4.Toxicología de las aminas biogénicas.
1.5.Producción de aminas biogénicas.
1.5.1 Descarboxilación aminoácidos Q.
-1.5.2.Microorganismos productores de oaminas biogénicas.
1.6.Mét0dos analiticos aplicados 21 la valoracién dé la capacidad de producción de aminas por parte de los microorganismos: Detección y cuantificación
1.6.1.Métodos para detectar microorganismos con capacidad aminobiogénica
1.6.2. Métodos analíticos para detectar animas en alimentos
1.7.Degradación de aminas biogénicas
1.7.1.Quinoproteinas amino oxidasas.
1.7.2. Quinohemoproteínas amino deshidrogénasas.
1.7.3. Quinohemoproteínas amino deshidrogénasas
1.7.4. Desaminación de tiramina
OBJETIVOS
MATERIALES Y METODOS.
MICROORGANISMOS UTILIZADOS
2.VECTORES UTILIZADOS.
3.MEDIOS DE CULTIVO
4.MANTENIMIENTO Y CRECIMIENTO DE LOS MICROORGANISMOS
5.ADITIVOS SUPLEMENTADOS ALOS MEDIOS DE CULTIVO.
6.METODOS GENERALES PARA EL ANALISIS Y/O TRATAMIENTO DE LAS
MUESTRAS DE DNA.
6.1.Aislamiento de DNA genómico de Pseudomonas putida
6.2.Aislamiento de DNA plasmídico de Lactocococcus.
7. TRANSFORMACION DE LACOTOCOCCUS LACTIS.
8. ANALISIS DE LAS SECUENCIAS DE DNA.
9. OBTENCION DE CEPAS MUTANTES DE P. PUTIDA.
9.1. Mutagénesis con el transposón Tn5.
9.1.1. Identificación del punto de inserción del transposón Tn5 en el DNA genómico
9.1.2. Identificación del punto de inserción del transposón Tn5 en el DNA genómico mediante la estrategia de “recombinación en el brazo del Tn5”.
9.1.3. Secuenciación de las zonas adyacentes a un fragmento de secuencia conocida.
9.2. Disrupción genética mediante recombinación de un fragmento homólogo
9.3. Obtención·de mutantes mediante deleción
10. ANALISIS DE LOS CALDOS IDE CULTIVO MEDIANTE CROMATOGRAFIA LIQUIDA DE ALTA RESOLUCION (HPLC)
11. DETERMINACION DE LA ACTIVIDAD 4-HIDROXIFENILACETATO 3-HIDROXILÁSICA
RESULTADOS Y DISCUSION
1. AISLAMIENTO DE- MUTANTES INCAPACES DE DEGRADAR TIRAMINA.
2. ANALISIS MEDIANTE 5 HPLC DE LOS METABOLITOS ACUMULADOS EN LOS CALDOS DE CULTIVO POR LOS DISTINTOS MUTANTES.
3. IDENTIFICACION DEL PUNTO DE INSERCION DEL TRANSPOSON TN5 Y SECUENCIACION DE LAS ZONAS ADYACENTES
3.1. Identificación del punto de inserción del transposón Tn5 en el DNA genómico mediante la estrategia de "recombinación en el brazo del Tn5"
4. ANALISIS DE LOS DIFERENTES CLUSTERS IMPLICADOS EN
LADEGRADACION DE TIRAMINA Y DE ACIDO 4-OH-FENILACETICO EN P.PUTIDA U.
4.1.Ruta catabólica de degradación de tiramina.
4.1.1 Organización genética del cluster tyn.
4.1.1.1.Desamil1aci6n de la tirzuijina.
- Gen tynA
- Gen tynB
- Gen tynC
4.1.1.2. Oxidación de1 4-hidroxifenilacetaldehódo.
- Gen tynC
- ORF 2
4.1.1.3. Regulación de la ruta tyn de Conversión de la- tiramina; en 4-OH-PhAc
- Gen tynC
4.1.1.4. Otros ORFs presentes en el cluster tyn.
- ORF 1.
- ORF 3.
4.1.2.Análisis comparativo de otros posibles cluster tyn presentes en diferentes microorganismos.
4.2. Ruta catabólica de degradación dé ácido 4-OH-fenilacético.
4.2.1. Organización genética del cluster hpa en P. putida U.
4.2.1.1. Hidroxi1ación del 4-OH-PhAc
- Operon hpaBC.
4.2.1.2. Etapa responsable de. la apertura en meta del anillo aromático del 3,4-diOH-PhAc.
- Gén hpaD
4.2.1.3. Continuación de la ruta meta de degradación del 3,4-diOH-PhAc
- Gen hpaE
- Gen hpaF
- Gen hpaG
- Gen·hpaH
- Gen hpaI
4.2.1.4. Transporte del 4-OH-PhAc
- Gen hpaX
4.2.1.5. Regulación de la ruta de degradación de1 3,4-diOH-PhAc
- Gen hpaE
- Gen hpaR
- Gen tetR
4.2.2. Análisis comparativo del cluster hpa en otros· microorganismos.
5. ANÁLISIS DE RESTRICCIÓN DE LOS CLUSTER TYN Y HPA DE P. PUTIDA U.
6. SECUENCIA DE LOS CLUSTER TYN Y HPA- DE P. PUTIDA U.
7. EXPRESIÓN HETERQLOGA DE LOS GENES IMPLICADOS EN LA DEGRADACIÓN DE TIRAMINA Y DE 4-OH-PHAC EN P. PUTIDA U
- Wpk-TBamHI
- WpK-TE y WpK-TE-B
- WpK-Tyr
- WpK-Tyr-6
- WpK-Tyr-2
- WpK-Tyr­4
- KT2440pK-TyrOH
8. ESTUDIO DE LA CAPACIDAD DEL CLUSTER TYN PARA DESAMINAR OTRAS AMINAS AROMATICAS.
- 2-feniletilamina
- Octopamina
- Triptamina e Histamina
- Dopamina
9. DERIVACION DE LA RUTA METABOLICA DE LA TIROSINA A TRAVES DE LA RUTA DE DEGRADACION DE TIRAMTNA Y 4-OH­PHAC EN P. PUTIDA U.
10. APLICACIONES BIOTECNOLÓGICAS.
CONCLUSIONES.
BIBLIOGRAFÍA.